Довольно неуклюже высказывая пожелание, чтобы такое никогда больше не случалось в будущем, парламент выступил против женщин в целом: «Женщин не дблжно ни в коем случае допускать к публичной власти в королевстве или позволять им иметь ее в стране».

Лорд Херрис объявил протест в отношении писем об отречении, назвал их недействительными и потребовал нанести визит Марии, чтобы лично услышать ее пожелания. Он возглавил парламентское меньшинство, отказавшееся подписать акт об отречении. Этот акт тем не менее был принят наряду с остальными актами, укреплявшими реформированную церковь, включая исповедание веры, заново утверждавшее положения кальвинистского учения, а также более радикальными актами, направленными против католиков. Партия Хэмилтонов на заседании парламента не присутствовала.

Морей провел два дня в Эдинбургском замке, а затем начал свое регентство с конфискации всего имущества Босуэлла, немедленно вынудив Патрика Уилсона, объявленного убийцей короля, передать ему замок Данбар. Эти действия имели более важное значение, нежели просто подчинение территорий, ведь именно в Данбаре хранилась основная часть драгоценностей Марии. Как она справедливо полагала, Морей наложил руку на всё, включая ее кольца. Мария знала, как это случается: так было с Дианой де Пуатье после смерти Генриха II и с ней самой после смерти Франциска II. В обоих случаях драгоценности становились собственностью короля, однако теперь Морей подарил некоторые из них жене, а остальные сохранил для себя.

В сентябре Морей принял делегацию лордов, преподнесших ему позолоченную посуду и задавших вопрос о его намерениях в отношении Босуэлла. Морей ответил им, что «не стоит делить шкуру неубитого медведя». Трокмортон также отметил, что Хэмилтоны «созвали вассалов на западе страны». 5 сентября Бедфорд сообщил Сесилу, что Морей собирается выступить против них с оружием в руках. Однако 15 сентября Морей принял Аргайла и Хэмилтонов для обсуждения спорных вопросов. Это, должно быть, оказалось бесполезным, поскольку 17 сентября Хэмилтоны потребовали освободить королеву и призвать к ответственности убийц Дарнли. Они поклялись в верности Якову, однако как принцу, а не королю, и вознамерились «помочь лордам, которые поддержали наше дело». К тому времени они смогли собрать 400 пехотинцев и получили обещание, что будут присланы еще 9 тысяч. Ясно обрисовались противоборствующие стороны, хотя 14 октября Морей уверял Сесила: «Состояние королевства указывает на всеобщее спокойствие». Однако подводный камень — тайные письма из шкатулки, становившиеся все менее и менее тайными, — оказался на виду 16 сентября, когда Морей в присутствии лордов Тайного совета подписал расписку в получении ларца. Как и Мортон, он объявил письма подлинными.

Морею также пришлось столкнуться с извечной проблемой любого правительства: у него теперь «почти не осталось денег», и он начал распоряжаться драгоценностями Марии, продав некоторые из них всегда готовой к новым приобретениям Елизавете. Сама Мария постепенно смирялась со своим заключением, «нарастила жирок», «вместо ярости проявляла благодушие и уже разжалобила многих». Вероятно, она всегда имела склонность к полноте, но раньше контролировала свой вес при помощи постоянной физической активности. Лишенная этой возможности, она быстро располнела. Начиная с июня в замок стали приходить сундуки с одеждой и прочими вещами для пленной королевы, к которой теперь присоединилась Мэри Сетон, хотя от прежней роскоши королевского гардероба не осталось и следа. Среди присланного были ткань для вышивания и для платьев, новые туфли, головные платки, нижнее белье и даже накладные волосы для прически. Подобно всем заключенным, Мария постоянно надеялась на освобождение, но в то же время страшилась событий, которые разворачивались за стенами ее темницы.

У второстепенных участников заговора против Дарнли исторгли признания, и они были казнены с варварской жестокостью. Их признания показывали, что главным организатором заговора был Босуэлл, теперь благополучно пребывавший в заграничной тюрьме, а его жена, бывшая королева, являлась его соучастницей. Все это было вполне удовлетворительно, и прочие лорды, подписавшие Крейгмилларское соглашение, могли спать спокойно в своих постелях. Лорды даже размышляли о возможности нового брака для Марии — она все еще оставалась женой Босуэлла, но эту неприятную деталь легко было исправить — и приняли во внимание целый ряд возможных кандидатов из числа знати, хотя саму Марию вряд ли спросили.

Она все еще оставалась пленницей, мечтавшей о побеге. Однако Мария хотела бежать из Лохливена не для того, чтобы бороться за королевскую власть, но скорее чтобы вновь наслаждаться жизнью принцессы. Она написала Екатерине Медичи и Елизавете, прося о помощи, причем ей удалось тайно переправить письма за пределы замка. Впрочем, ни одна из правительниц не была склонна рисковать, чтобы спасти королеву, обвинявшуюся в убийстве мужа. Возможности самой Марии организовать побег были незначительными, ведь, чтобы написать эти письма, ей даже пришлось изготовлять чернила из каминной сажи. Она смогла очаровать лодочника, переправившего ее послания, но вся остальная прислуга находилась под постоянным наблюдением: тюремщики Марии были такими же пленниками, как и она сама. Королева, однако, превратила в своего добровольного помощника Джорджа Дугласа, младшего брата сэра Уильяма. Когда брат приказал ему покинуть остров после одной из многочисленных ссор в семействе Дугласов, Джордж сумел вступить в контакт с лордом Сетоном, верным сторонником Марии.

Первая попытка побега Марии, состоявшаяся в конце весны, предполагала переодевание в прачку, а Мэри Сетон в это время должна была оставаться на острове и играть роль королевы. Однако один из лодочников заподозрил, кем на самом деле являлась служанка шести футов ростом, и попытался сорвать закрывавший ее лицо шарф. Мария инстинктивно схватилась за шарф, выдав себя — ведь руки у прачки красные и огрубевшие от постоянной стирки, а руки женщины в лодке были белыми, с изящными длинными пальцами. Хотя королева вернулась в свою тюрьму, лодочник никому не сказал о попытке побега.

Теперь Мария использовала в качестве курьера юного сироту Уилли Дугласа, однако он был ненадежен и даже умудрился потерять адресованные ей письма, которые нашла дочь лэрда. Девочка обещала сохранить все в секрете, если Мария возьмет ее с собой, но та, почувствовав возможную ловушку, ответила, что не имеет намерения бежать. Уилли, которого Мария вознаградила золотыми, был обвинен в подготовке побега и изгнан с острова. Удивительно, но сэр Уильям и леди Дуглас не усилили мер безопасности, однако похвалялись перед самой Марией, что хорошенько о ней позаботятся. Тем временем Джордж Дуглас и лорд Сетон собрали группу вооруженных людей в прибрежной деревне у Лохливена и ждали там известий. Юному Уилли позволили вернуться, и он сообщил Марии, что ее побег запланирован на 2 мая.

Незадолго до назначенного срока произошла случайная заварушка, когда слуги подняли ложную тревогу, обернувшуюся бедой: один из людей сэра Уильяма схватил аркебузу — считая, как он утверждал позднее, что она заряжена только пыжом, — и выстрелил в толпу, ранив двоих зевак.

2 мая Уилли организовал праздник Неразумия, на котором он сам был Аббатом Беспорядка, и настоял на том, чтобы Мария следовала за ним повсюду, куда бы он ни пошел. Благодаря этому ему удалось нарушить заведенный в замке распорядок и отвлечь внимание от действий, которые в обычной обстановке вызвали бы всеобщую тревогу. В прибрежной деревне появилась большая группа вооруженных всадников во главе с Джеймсом Хэмилтоном из Ормистона, а сама Мария до ужина удерживала леди Дуглас беседой, чтобы та не увидела их. Сэр Уильям заметил, как Уилли сковывал цепью и привязывал все лодки на острове, кроме одной, но Марии удалось отвлечь и его внимание. Мария получила от Джорджа Дугласа жемчужину при посредничестве подкупленного крупной взяткой лодочника — это был сигнал, означавший, что все готово.