В субботу, 9 февраля Дарнли пребывал в отличном настроении. Его гнойники исчезли, и он считал себя излечившимся, хотя на самом деле болезнь просто достигла очередной стадии. Однако королю больше не нужно было принимать сероводородные ванны, и он предвкушал возвращение в Холируд. Таким образом, у заговорщиков оставался последний шанс добраться до него. Мария тоже была в хорошем настроении, поскольку это был последний день перед Великим постом. Утром Мария, подарившая невесте подвенечное платье, присутствовала на венчании Себастьяна и Кристины и удалилась, обещав вернуться на свадебный пир позднее. В четыре часа дня она была на официальном обеде, данном епископом Аргайлским в честь отбывавшего на родину савойского посла Моретты. Затем около восьми часов Мария в сопровождении Босуэлла, Аргайла и Хантли посетила Дарнли. Позднее она сдержит обещание и посетит свадебный пир, и некоторые источники утверждают, что она прибыла в Кирк-о-Филд в маскарадном костюме. Примечательно, что в этот момент Морею пришлось срочно вернуться в свой дом в Сент-Эндрюсе к жене, незадолго до того пережившей выкидыш. Находясь на пароме, пересекавшем реку Форт, Морей сказал стоявшему рядом с ним лорду Херрису и другим спутникам: «В эту ночь король расстанется с жизнью». У Летингтона оказалась не менее срочная работа во дворце, а Мортон все еще должен был соблюдать комендантский час — то было одним из условий его прощения. Таким образом, алиби были тщательно подготовлены.

Мария провела вечер с Дарнли, а ее дворяне в это время играли в карты и кости. В комнате на первом этаже постель королевы сдвинули с места, а Уильям Гаури перенес порох из дома Балфура и поместил его непосредственно под комнатой Дарнли. Чтобы добиться наибольшего разрушительного эффекта, порох нужно воспламенить в замкнутом пространстве.

Похоже, что заговорщики использовали кожаные сумки. За работой наблюдал Джеймс Куллен, солдат-наемник из Эдинбургского замка, имевший большой опыт обращения с боеприпасами. После того как дело было завершено, Марии напомнили, что она обещала посетить свадебный пир Себастьяна, и королева начала готовиться к отъезду. Она нежно поговорила с Дарнли, который выказывал ей свою привязанность на протяжении всего вечера и, к ужасу заговорщиков, умолял ее остаться. К их великому облегчению, Мария пожелала ему спокойной ночи, подарила кольцо и обещала допустить в свою постель на следующую ночь. Когда она вышла из дома во двор, то встретила там своего французского пажа Николя Юбера по прозвищу Французский Парис, который весь перемазался в порохе, и воскликнула: «О Господи, Парис, как же ты перемазался!» В этот момент Мария была опасно близка к тому, чтобы признать: она понимает, что происходит, однако сразу после этого эпизода она ускакала на свадьбу и приняла участие в слегка неприличной церемонии укладывания новобрачной в постель. После полуночи Мария уже благополучно спала в своей спальне в Холируде.

В доме на Кирк-о-Филд Дарнли продолжал напиваться в компании Уильяма Тейлора, а потом тоже отправился в постель. Тейлор, как обычно, заснул на полу в спальне короля. Однако не все в доме спали: Хэй и Хёпберн несли стражу на первом этаже, рядом с запасами пороха.

Картину того, что произошло потом, можно составить из отрывков различных сообщений, которые подозрительно схожи в одном: практически все они обвиняют Босуэлла. Около двух часов утра к стенам Кирк-о-Филд по приказу Мортона и Босуэлла прибыл Кер из Фаудонсайда с отрядом вооруженных людей. Сад к тому времени уже заполнили люди, приведенные Арчибальдом Дугласом, все с факелами — ночь была безлунной — и хорошо вооруженные. Дугласы были родственниками Босуэлла, и именно в Уиттинхэме, замке Арчибальда Дугласа, были согласованы последние детали. Прибытие этих людей отнюдь не было бесшумным и разбудило двух местных домохозяек — Барбару Мартин и Маргарет Крокетт, которые впоследствии показали под присягой, что видели, как тринадцать мужчин прошли через Каугейт. Шум разбудил и Дарнли, и Уильяма Тейлора, которые догадались, что им грозит опасность, и попытались бежать. Поняв, что если они выйдут из парадной двери, то окажутся в руках Дугласа и его людей, они вылезли из окна, причем Дарнли по-прежнему был одет в ночную рубашку, но завернулся в меховое покрывало. Мужчины использовали сооружение из веревки и стула, чтобы спуститься на шестнадцать футов по стене, а затем взяли веревку и стул с собой, чтобы перебраться через стену сада. Именно когда они перелезали через дальнюю стену сада в Воровской переулок, их и заметили люди Дугласа. Беглецов быстро схватили и задушили на месте. Но даже если бы Дарнли и Тейлору удалось перебраться через стену, они бы оказались в засаде, устроенной Кером из Фаудонсайда и его людьми. Нападавшие, возможно, и не ведали, кого убили, хотя Дарнли, похоже, узнал ливрею Дугласов из Уиттинхэма. Сам Дуглас сначала не знал, что обоих беглецов убили. В любом случае в первый момент он мог решить, что убитые были простыми слугами.

Примерно в то же время Босуэлл и два его друга покинули Холируд и пошли по Хай-стрит, идущей параллельно Каугейт. Затем они вошли в пределы Эдинбурга через Незербоу Гейт, спустились по Блэкфрайарс Винд, пересекли Каугейт и пришли к Кикр-о-Филд. Они появились там сразу после того, как задушили Дарнли. Подойдя к дому, Босуэлл нашел у дверей Хэя и Хёпберна. Заговорщики подожгли запал, заперли двери дома и быстро отступили во двор. Спустя некоторое время Босуэлл решил, что запал потух, и уже собирался войти в дом, чтобы проверить его, но Хёпберн вовремя остановил его: в этот момент порох под опустевшей спальней взорвался.

«Там ничего не осталось, все разметало по сторонам и разорвало в клочья, не только крышу и полы, но и стены до самого фундамента, так что на месте не было ни одно камня». Все было «разрушено». На самом деле людям Дугласа повезло — они не были ранены разлетевшимися по сторонам камнями, пока отъезжали в безопасное место; именно тогда их опять заметили две домохозяйки, назвавшие их изменниками и решившие, что те занимались каким-то «дурным делом». В своих показаниях добрые женщины также утверждали, что слышали, как Дарнли умолял своих родственников о милосердии (ведь Дугласы были его родственниками). Когда эти женщины, единственные беспристрастные свидетельницы, давали свои показания, «у них вырвались слова, которых дознаватели не ожидали и отвергли как поспешные и глупые».

Что до прочих обитателей дома, то двое слуг, спавших в коридоре, — Нелсон и Саймондс — похоже, последовали за Дарнли и Тейлором и тоже вылезли из окна, возможно, услышав, как закрыли двери. Нелсон был жив и здоров, на полпути к городу, когда его обнаружили. Двух других слуг нашли мертвыми среди обломков, но все остальные остались живы. Дарнли был мертв, однако для этого взрыв оказался не нужен.

Взрыв, сравнимый с «залпом 25 или 30 пушек, перебудил весь город», и люди устремились на место преступления, где осевшая пыль обнажила размеры разрушений. Неподалеку обнаружили капитана Уильяма Блэкедерра, сторонника Босуэлла; его немедленно арестовали, однако освободили, когда выяснилось, что он был всего лишь ночным гулякой, возвращавшимся домой после попойки неподалеку от Трона, общедоступного подвесного моста. Босуэлла, как шерифа Эдинбурга, призвали заняться расследованием. В своих сомнительных показаниях, данных в 1568 году, он утверждал, что был тогда в постели с женой, «своей первой принцессой, сестрой графа Хантли». В своей биографии Марии Стюарт Антония Фрейзер мудро указывает, что к подобному алиби питали пристрастие преступники всех времен. Босуэлл устроил так, чтобы тело Дарнли осмотрели те члены Тайного совета, которые тогда находились в Эдинбурге, — почти все они принимали участие в заговоре, — но иностранным послам, которые просили разрешения взглянуть на тело, было в этом отказано. Тело перевезли в Холируд; там Мария заплатила 42 фунта 6 шиллингов за его бальзамирование. Мария «не выказала никаких признаков, по которым можно было бы судить о глубоких чувствах, таившихся в ее сердце». 15 февраля 1567 года Дарнли похоронили в Холирудском аббатстве рядом с Яковом V и отслужили погребальную мессу. Для Марии начался сорокадневный траур, и по соображениям безопасности она вернулась в Эдинбургский замок.