Так или иначе, Елизавете было не до тонкостей: в марте она потребовала, чтобы Мария «навсегда прекратила» использовать английский герб, и приказала ко 2 апреля вывести французские войска из Шотландии. Елизавета также призвала всех шотландцев признать Марию своей правительницей; все государственные должности следовало оставить в том виде, «в каком они существовали обычно в Шотландии», а все епископства и церковные владения передать прирожденным шотландцам. Другими словами, Елизавета требовала устранения всех чиновников-французов.

Затем 23 марта Сесил через Тайный совет отправил Елизавете меморандум. «Королева Шотландии, ее муж и семья Гизов являются смертельными врагами Ее Величества… Их злоба направлена против ее личности, и они не остановятся до тех пор, пока жива шотландская королева». Сесил, понимавший страхи своей госпожи, перешел от политических советов к предупреждениям об угрозе жизни королевы.

В то же самое время Франциск II и Мария оказались под угрозой со стороны заговорщиков из Юге. Двор пребывал в Блуана-Луаре, где Франциск II мог спокойно охотиться, пока Мария и Екатерина слушали проповеди и вместе ходили к мессе. Это была мирная передышка, но именно тогда заговорщики под началом сеньора де ла Реноди решили захватить братьев Гизов, убедить короля даровать гугенотам свободу вероисповедания, а затем передать права регентства Луи де Конде и Бурбонам. Заговор был очень плохо организован: учитывая, что 500 агентов отправились искать поддержки даже в Англии, невозможно было сохранить его в тайне. Когда известия о заговоре достигли двора, герцог де Гиз приказал немедленно перебраться в замок Амбуаз в пятнадцати милях ниже по течению Луары. Замок стоял на обрыве над рекой и был практически неприступен; его вряд ли могли захватить те, кто вот-вот должен был превратиться в отряд мятежников. Мятежники, среди которых было много недовольных сельских жителей, не имели единого командования, но просто рыскали вокруг, так и не соединившись в значительный отряд. К мятежным войскам примкнуло несколько недовольных дворян из все возраставшего числа противников Гизов. Опасаясь, что серьезным лидером мятежников может стать главный гугенот Франции Луи де Конде, присутствовавший в замке, Екатерина просто назначила его главой личной охраны короля. В своем новом качестве Конде обязан был постоянно присутствовать в замке.

В начале марта схватили и отправили на дыбу первую группу заговорщиков. Впоследствии основной отряд был захвачен по частям, по мере прибытия заговорщиков к замку с целью окружить его, а самого де ла Реноди, к счастью, застрелил аркебузир — к счастью, потому что после того, как остальные были схвачены, их подвергли садистским пыткам, прежде чем казнить. К удивлению партии короля, многие из восставших были немцами, швейцарцами, савоярами, англичанами и даже шотландцами, действовавшими не как наемники, но как «солдаты Бога». Пленников было гак много, что из соображений скорости и экономии средств герцог де Гиз приказал зашить многих из них в мешки или связать в группы по десять человек и бросить в реку, где они и утонули. Пятьдесят два знатных пленника дворянской крови были обезглавлены на эшафоте. Герцог и Екатерина Медичи лично наблюдали за всеми казнями; тела казненных были затем повешены на стенах замка для устрашения горожан, а головы насадили на столбы под окнами королевской столовой. «По улицам Амбуаза текла кровь, река была покрыта телами, а во всех общественных местах стояли виселицы». Мария впервые увидела жестокие казни, вызванные религиозными раздорами; она не могла не знать о том, что происходило. Франциск II писал епископу Лиможскому: «Смерть нескольких несчастных сохранит мир и спокойствие всего королевства». Подруга Марии Анна д’Эсте плакала при виде кровопролития; оно ужаснуло и сестру бывшего коннетабля Луизу де Монморанси. Элеонора де Конде и мадам де Крюссоль — считавшиеся опорой гугенотов — также были близки Марии, и она вполне могла бы подпасть под политическое влияние этих могущественных дам. Однако сама Мария не принимала участия в борьбе религиозных партий, разрывавшей Францию. Мария просто верила тому, что говорили ей ее дяди Гизы, поскольку это требовало меньше интеллектуальных усилий.

Герцог де Конде попытался свести обе стороны вместе и лично просил Франциска II проявить больше терпимости к гугенотам и созвать Генеральные штаты (ближайший аналог национального парламента, существовавший в то время), но по совету братьев Гизов Франциск арестовал Конде и приговорил его к смерти. Власть Гизов теперь стала невыносимой для всех, за исключением небольшого числа лиц, окружавших короля, и даже внутри этого круга Екатерина Медичи сочла, что уже слишком давно находится в стороне. Сразу после смерти Генриха II она поняла, что у нее нет шансов утвердиться у власти в присутствии братьев Гизов и при их полном контроле над королем, осуществляемом через Марию. Екатерина поняла и то, что не стоит вести войну, которую невозможно выиграть; поэтому она стояла в стороне, наблюдая, как братья укрепляют свою власть и наживают множество врагов. Она сама лично никогда не помогала их врагам — ведь многие из них были гугенотами, а Екатерина была благочестивой католичкой, — но тем не менее вела переговоры с Елизаветой I и Филиппом II Испанским. Филипп, женатый на дочери Екатерины, с беспокойством наблюдал за возраставшими амбициями северного соседа и за французским окружением Англии и был бы рад подрезать Гизам крылья. Если бы удалось убедить Елизавету выступить от имени протестантских лордов Шотландии, с регентством Марии де Гиз там было бы покончено и тем самым возникла бы первая трещина в здании, возведенном могуществом Гизов. Таким образом, католический монарх мог поддерживать протестанта, если того требовали государственные интересы.

К 25 апреля, пробыв королевой меньше года, даже политически наивная Мария осознала, что непримиримость ее дядей может вылиться в потерю Шотландии. Она «горько плакала, приговаривая, что дяди погубили ее». Из самой Шотландии приходили дурные известия. 26 апреля в Эдинбурге Марию де Гиз едва не захватили лорды конгрегации. Венецианский посол Джованни Суриан сообщал, что, получив эти вести, Мария «безостановочно лила горькие слезы и в конце концов слегла от тоски и горя».

10 июня 1560 года, измученная постоянными сражениями с шотландской знатью и угрожавшими ее столице английскими войсками, Мария де Гиз умерла. Ее тело сильно распухло от водянки. В апреле она говорила французскому послу Анри Клётену, сеньору д’Уазелю, ставшему ее главным советником в Шотландии: «Я все еще хромаю, а моя нога распухла. Если нажать на нее пальцем, он проваливается в нее как в масло». Водянка — патологическое скопление жидкости, зачастую являющееся следствием расстройства сердечно-сосудистой системы, и королева-регентша скорее всего умерла от сердечной недостаточности. Ее тело было «одето в свинец» и 19 октября морем отправлено во Францию для похорон в женском монастыре Сен-Пьер в Реймсе, аббатисой которого была ее сестра Рене де Гиз.

Новость скрывали от Марии в течение двух недель — до 28 июня. Узнав обо всем, Мария впала в глубокое отчаяние, что вполне понятно. Известие о смерти матери принес ей дядя Шарль, кардинал Лотарингский, приходившийся покойной королеве-регентше братом. Венецианский посол писал дожу: «Ваша Светлость может себе представить грусть Гизов, братьев Ее Величества, а также и страдания наихристианнейшей королевы, удивительно сильно, более, чем другие дочери, любившей свою мать». После смерти самой Марии Стюарт самой большой ценностью оказался миниатюрный портрет ее матери.