Этот военно-морской выпад рыцарей против новоявленного алжирского правителя прошел успешно: по некоторым источникам, было освобождено 10 тыс. пленников-христиан. Однако через шесть лет Хайреддин взял убедительный реванш, разбив силы Карла V под г. Алжиром. В кампании вновь участвовали госпитальеры, понесшие ощутимые потери: испанский флот, в который влились их корабли, был разметен и практически уничтожен жестоким штормом. Рыцарям приходилось туго: в военных предприятиях их преследовали неудачи; еще хуже обстояло дело с финансами, и уж совсем плохо складывались дела внутри ордена. За десятилетие, прошедшее с момента воцарения ордена на Мальте, значительно обострились разногласия рядовых рыцарей с орденской верхушкой, вызванные чрезмерными амбициями великого магистра с его окружением и стремлением молодых членов братства освободиться от суровой дисциплины и мелочной опеки.

Время шло, а неудачи продолжались, как во внутренних делах, так и в международных. В 1540 году орден постигла двойная неудача, усугубившая его и без того сложное положение: он потерял свои владения и, следовательно, огромные доходы в Англии и Германии. Предлогом для конфискации владений послужили события Реформации: местные монархи и князья увидели прекрасную возможность укрепить свою власть и освободиться от диктата Рима.

Причем, если в Германии дела ордена отныне были не слишком хороши, то в Англии совсем плохи. Мальтийский орден, распущенный специальным королевским эдиктом, перестал существовать как таковой, а рыцарям было предоставлено право выехать на Мальту в качестве частных лиц или остаться на службе у Генриха VIII — и многие из них предпочли остаться и поступить на службу. В лоскутных немецких государствах судьба госпитальеров сложилась несколько иначе. В южных княжествах, оставшихся католическими, ордену удалось сохранить значительные преимущества; зато в землях, вошедших в так называемую протестантскую группировку, они не только потеряли все, что имели, но и вынуждены были образовать совершенно самостоятельную ветвь — Прусский орден иоаннитов (1540 г.), исповедовавший лютеранство.

Ну а что же происходило на Мальте и в новой резиденции ордена? Пока на материке бушевали политические, идеологические и военные бури, жизнь на вверенном рыцарям острове шла своим чередом. С конца 40-х годов XVI века турки возобновили наступление на европейские позиции в Средиземноморье. В 1547 году на Мальте неожиданно высадился турецкий отряд. Быстро опустошив побережье, он так же внезапно и удалился, прежде чем госпитальеры смогли что-либо предпринять. Еще более серьезным предупреждением ордену явилось османское вторжение 1551 года, когда отряду Синан-паши удалось разорить значительную территорию самой Мальты и практически полностью — остров Гоццо, захватив в плен около 5 тыс. человек.

На этом фоне падение крепости Триполи воспринималось госпитальерами скорее как облегчение: отныне им уже не было нужды бороться на два фронта. Хотя, конечно, это событие еще больше упрочило позиции Османской империи в Северной Африке и в Центральном Средиземноморье. Вместе с тем суровые испытания, последовавшие одно за другим в течение неполных четырех лет, заставили орден по-новому взглянуть на роль Мальты и на свои задачи, связанные с пребыванием на острове. Прежде всего, как показали турецкие рейды, Мальту следовало срочно укрепить.

В 1557 году эстафету великого магистра и руководителя ордена принял Жан Паризо де ла Валетт (1557–1568), личность, по свидетельству современников, незаурядная. Впрочем, весьма вероятно, что человеком-легендой его сделали обстоятельства так называемой Великой осады (1565 г.).

Тем временем между рыцарями ордена и турками снова назревало столкновение. Семидесятилетний султан Сулейман I Великолепный, достигший апогея своего могущества, но не забывший давнего побежденного врага, решил раз и навсегда покончить с претензиями испанцев и итальянцев на владычество в Средиземном море и превратить его в такие же внутренние турецкие воды, каковыми стали Черное и Мраморное моря. Для этого нужно было, по его мысли, всего несколько последних усилий, из которых самым легким представлялось нападение на Мальту — крошечный, но крайне неприятный оплот христианства в Средиземноморье. Вот почему острие копья Сулеймана, как и сорок два года назад, оказалось вновь направленным против госпитальеров. И вскоре турецкая армада, усиленная судами алжирских корсаров, отправилась в «карательную экспедицию».

К Мальте подошла громадная по тем временам сила — 181 судно с 30 тыс. пехотинцев на борту. Во главе экспедиции стоял Мустафа-паша — тот самый, который уже однажды нанес ордену решительный удар, отняв у госпитальеров Родос. Турецким флотом командовал зять Сулеймана Пиали-паша, а флотилией алжирских пиратов — Тургут-реис (известный на западе под именем Драгут — «гроза морей»), способный военачальник, верой и правдой служивший Сулейману. Он тоже был «старым знакомым» госпитальеров: не кто иной, как Драгут дважды добивался серьезных успехов в борьбе с орденом, оба раза — в 1551 году, когда он изгнал рыцарский гарнизон из Триполи и опустошил Гоццо.

Турки приступили к осаде 18 мая 1565 года. Вряд ли для ла Валлетта это нападение было неожиданным: он заранее предпринял кое-какие меры организационного характера. На остров срочно были доставлены продовольствие и боеприпасы, съезжались боеспособные члены ордена и т. д. Но всего этого было явно недостаточно. Под началом великого магистра было тогда всего 700 рыцарей и около 7,5–8 тыс. солдат, в основном мальтийцев. Как отмечают старинные источники, «христианские государи, которых ла Валлетт молил о помощи, не спешили поддержать рыцарей», и орден вновь, как и на Родосе, оказался один на один с грозным врагом.

В исторические источники этот приступ с артиллерийским обстрелом форта вошел как Великая осада Мальты. Она продолжалась без малого четыре месяца (18 мая — 8 сентября 1565 г.). Гарнизон форта стоял насмерть в буквальном смысле. Только 21 июня, когда погибли все до одного его защитники, солдаты Мустафы-паши смогли войти в то, что еще оставалось от небольшой крепости. За неполный месяц турецкая армия потеряла 8 тыс. человек, от шальной пули погиб один из главных командиров осаждавших — Драгут, что вкупе с другими факторами оказало на тех сильное деморализующее влияние.

Обе противоборствующие стороны потеряли очень много солдат, но если для ордена это было смерти подобно, то турки постоянно получали подкрепление, в том числе и из Северной Африки. Так, в июле наместник султана в Алжире Хасан доставил на Мальту новый отряд, насчитывавший 2 тыс. человек, и штурм сразу же возобновился. Но ни алжирцам, ни пришедшим им на помощь янычарам так и не удалось преодолеть крепостные стены.

Когда вице-король Сицилии все-таки решил прийти на помощь Мальте, она уже истекала кровью. Однако, узнав об этом, защитники острова обрели второе дыхание и с новым упорством стали отстаивать каждую пядь земли. Несколько раз военное счастье как будто оказывалось на стороне превосходящих сил противника, но смелые действия мальтийцев в тылу турецкой армии и мужество тех, кто выдерживал лобовую атаку османов, грозили сорвать планы Мустафы-паши. С безрассудным упорством бросал он новые тысячи бессловесных солдат на, казалось бы, изнемогающих защитников форта. Силы ордена были на исходе, когда 7 сентября на горизонте показались сицилийские боевые корабли.