После падения Иерусалимского королевства и изгнания из него иоаннитов в конце XIII века они перебрались на Кипр, захваченный еще в 1191 году отрядами английского короля Ричарда Львиное Сердце и проданный тамплиерам, которые потом уступили остров королю Иерусалимскому Ги де Лузиньяну (эта династия удерживала за собой остров до 1489 г.). Стараниями великого магистра госпитальеров Жана де Вилье у них на Кипре уже были замки в Никосии, Колосси и других местах. Отход на Кипр был достаточно боевым: Жан де Вилье и его рыцари мечами прорубили себе дорогу на орденскую галеру, в то время как с палубы прикрывавшие их доблестный отход лучники обрушивали град стрел на врага, стремившегося уничтожить последних из оставшихся в живых героев великой христианской армии. Разбитые и раненые, но не покоренные и не сломленные, рыцари высадились на Кипре, где король Ги де Лузиньян дружески встретил их. Орден стал вассалом короля Кипра и получил от него феодальное владение Лимассол (Лимиссо).

Здесь произошло слияние госпитальеров с еще одним орденом, также изгнанным из Иерусалима, — орденом Святого Самсона. Этот союз стал именоваться «рыцари Кипра». Подарок короля Кипра был утвержден римским папой Климентом V. В Лимассоле в течение восемнадцати лет располагалась резиденция ордена.

В новой резиденции был созван генеральный капитул, и, пожалуй, такого многолюдного собрания не было со времени основания ордена. Некоторые из кавалеров советовали великому магистру переселиться в Италию, но он и прочие старшие кавалеры, не теряя надежды возвратить когда-либо землю обетованную, отвергли предложение первых, а решились на время остаться в Лимассоле. Здесь великий магистр основал гостиницу, повелел кавалерам вооружить суда, на которых они прибыли в Кипр, и использовать их для защиты паломников, которые и после потери христианами Иерусалима не преставали посещать святые места.

Но на этом переселения рыцарского ордена не закончились. Из-за непостоянства кипрского короля великий магистр решился переменить место резиденции. В соответствии со средневековым ленным правом орден, хотя и сохранял определенную свободу в решении собственных дел, вынужден был находиться в некоторой зависимости у своего сеньора, что выражалось, в частности, в уплате дани и несении воинской повинности. Но у великого магистра Гийома де Вилларе отношения с сеньором де Лузиньяном не сложились, и гордый рыцарь стал подыскивать себе другое место.

Годы, проведенные на Кипре, не прошли даром, они позволили ордену восстановить силы. Казна наполнилась поступлениями из Европы, а также добычей от морских побед над корсарами и турками. Увеличился приток новых рыцарей из Европы, орден вновь обрел былое могущество. В то время как ордены тамплиеров и тевтонцев после утраты Святой земли переместились в родные страны и, несмотря на свое значение, в конце концов оказались в зависимости от своих сеньоров, рыцари ордена Святого Иоанна не хотели иметь сеньора, они решились на завоевание острова Родос. В 1307–1309 годах госпитальеры завоевали остров и впоследствии основали на нем мощную крепость и госпиталь. А в 1310 году на Родос была официально перенесена штаб-квартира ордена. Первой заботой рыцарей стало укрепление старых византийских фортификаций острова и строительство госпиталя.

Рыцари ордена оказались дальновидны: вскорости их ждала опасность, так что обновление оборонительных укреплений стало вовсе не пустой предосторожностью. Всего через два года после появления рыцарей на Родосе турки предприняли попытку завладеть островом Аморгос, лежащим в ста милях к северо-западу от Родоса. Великий магистр Фульк де Вилларе бросил на разгром неприятеля все силы ордена, и в морском сражении у берегов Аморгоса турки потеряли весь свой флот.

С турками крестоносцы находились в состоянии войны долгие годы. Военные операции велись практически непрерывно до последней четверти XV века, и они рождали своих героев. Один из них был Дьедонне де Гозон, избранный великим магистром в 1346 году. Под предводительством де Гозона рыцари одержали внушительную победу над турецким флотом у берегов Смирны. Этот город оставался их форпостом в Малой Азии до тех пор, пока в 1402 году не пал под ударами армий Тимура.

Европа не собиралась спускать с рук туркам разгром крестоносцев: вторая половина XIV века отмечена непрестанными попытками взять реванш. В 1365 году папа Урбан V призвал к новому крестовому походу против неверных. Подготовку к нему возглавил король Кипра Петр I. Летом 1365 года у берегов Кипра собралась армада парусников, галер и транспортных судов, на борту которых находились рыцари и воины из разных стран Европы. Были там и галеры ордена Святого Иоанна. Турки не сомневались, что главный удар будет нанесен по Сирии. Однако корабли крестоносцев направились в сторону Александрии, остававшейся одним из красивейших и богатейших городов Северной Африки. Город был взят приступом, разграблен, предан огню и мечу. Крестоносцы с беспощадным варварством истребляли мирное население, не делая различия между мусульманами, христианами и евреями. Когда перегруженные богатой добычей корабли крестоносцев вернулись на Кипр, стало ясно, что любая попытка развить первый успех обречена на неудачу. Большая часть крестоносного воинства дезертировала. Однако арабы и турки надолго запомнили безжалостную резню, устроенную крестоносцами в Александрии. Через 60 лет они захватили и опустошили Кипр. С падением Кипра с карты Восточного Средиземноморья исчезло последнее латинское королевство, орден Святого Иоанна остался один на один с набиравшей силу державой турок-османов.

Воинственный дух рыцарей не позволял им сидеть на месте. Через два года после разграбления Александрии госпитальеры предприняли успешную морскую экспедицию к берегам Сирии. Десант, высаженный с орденских галер, вернулся с богатой добычей. С этих пор морские набеги на города Леванта, Египта и Малой Азии стали совершаться регулярно. Рыцари поняли, что лучший способ борьбы с превосходящим по численности противником — внезапное нападение.

Как видно, поколению иоаннитов конца XIV века не давали покоя рассказы отцов и дедов о крестовых походах — орден Святого Иоанна принял участие в последней попытке средневековой Европы возродить времена славы крестоносцев. Стотысячная армия под командованием старшего сына герцога Бургундского выступила в поход, намереваясь вытеснить турок с территорий, занятых ими за Дунаем. Крестоносцы лелеяли надежду повторить успех Первого крестового похода, пройдя через Анатолию до Иерусалима. Совместно с генуэзцами и венецианцами госпитальеры должны были обеспечить поддержку с моря. Орденский флот под командованием великого магистра Филибера де Найяка вошел в Черное море через Дарданеллы и Босфор и встал на якорь рядом с устьем Дуная. Однако в боевых действиях участвовать ему не пришлось. Огромная, но плохо организованная и крайне недисциплинированная армия крестоносцев была наголову разбита легкой кавалерией турок у города Никополиса.

Противостояние сразу нескольких противоборствующих сил до предела осложнило обстановку в Леванте. Особенно это почувствовалось после захвата Багдада войсками Тимура в 1392 году. В 1403 году госпитальеры, никогда не колебавшиеся перед заключением временных союзов со своими вчерашними врагами против нового могущественного противника, договариваются о совместных действиях с египетскими мамлюками. Согласно условиям соглашения, орден получал право открыть свои представительства в Дамиетте и Рамле и восстановить свой старый госпиталь в Иерусалиме. Эта договоренность с мамлюками принесла ордену почти четыре десятилетия мирной передышки. Тем не менее работы по возведению новых фортификационных сооружений на Родосе продолжались, а галеры регулярно выходили в море из порта Мандраччио.