В те же годы казачество зарождалось и на русских землях входивших в состав Великого княжества Литовского. Уходя от тяжелого панского гнета, многие жители Приднепровского края бежали «за пороги», на впадающие в Днепр и Южный Буг степные реки. Первые достоверные известия о поселениях казаков в низовьях Днепра относятся к 1489 г. (в Подолии) и 1492 г. (на Киевщине). Центром возникшего в нижнем течении Днепра казачьего района стал остров Томаковка (Буцкий остров), затем, во времена Дмитрия Ивановича Вишневецкого — о. Хортица, с сохранением Сечи на Томаковке. После уничтожения татарами в 1593 г. Томаковской Сечи (во время похода запорожцев на Киев) казаки перенесли свое главное поселение на остров Базавлук. Как и в Московском государстве, многие днепровские казаки поступали на службу к польскому королю, зачисляясь в так называемое «реестровое казачество».

Со временем русский элемент среди селившихся на Днепре и Дону казаков стал преобладающим. Тем не менее, даже в конце XV — начале XVI в. в «Поле» оставались и «ордынские казаки», совершавшие дерзкие нападения на русские «украйны». Постепенно они были оттеснены к Азову. Остатки этих «лихих казаков» (200 чел.) в 1503 г. пытался набрать на службу крымский «царевич» Бурнаш-Гирей. Дальнейшая судьба их неизвестна, но вполне возможно, что они вошли в состав донского казачества.

Интересы казачества постоянно сталкивались с силами, враждебными Русскому государству — Турцией, Крымским ханством, Ногайской ордой. Немногочисленные, но хорошо организованные казачьи отряды наносили противнику серьезный урон, вынуждая его считаться с собой.

Появление враждебного татарам вольного казачества не могло не встревожить властителей Крымского юрта. Борьба русских казаков с татарами и ногаями наиболее ожесточенный характер приняла на рубеже XV и XVI вв. В 1515 г. диздар (комендант) Азова Бурган жаловался Василию III на мещерских казаков, в непосредственной близости от турецкой крепости пленивших трех местных жителей. В это время рязанские и мещерские казаки уже чувствовали себя хозяевами на Дону. Чтобы обезопасить подступы к Азову, турецкое правительство решило сбить казаков с этой реки. В 1519 г. против них были отправлены три каюка с янычарами, получившие приказ занять устье реки Воронеж. Московское правительство, встревоженное приближением турецких войск к русским владениям предложило Стамбулу установить на Хопре точно обозначенную границу, однако крымское вторжение 1521 г. перечеркнуло эти планы. Впрочем, утвердиться на Дону и Воронеже турки не смогли. «Заполяне» из рязанских и северских мест продолжали освоение Подонья в более благоприятных условиях — после нашествия Мухаммед-Гирея московские власти прекратили преследовать казаков. Более того, русские «украинные наместники», несомненно с ведома правительство стали поручать «заполянам» «отведывати людей на поле, нечто которые люди нашего недруга хотят прити на наши украинные места и лихо похотят учинить, и они б безвестно не прошли». Выполняли казаки и другие поручения Москвы. Так, в 1523 г. отправившихся вниз по Дону русских и турецких послов сопровождало 5 станиц рязанских казаков. В те годы шел интенсивный процесс объединения тюркского и русского казачества, нашедший отражение в документах. В 1538 г. из Москвы писали в Ногайскую орду: «На Поле ходят казаки многие: казанцы, азовцы, крымцы и иные баловни казаки; а из наших украин казаки, с ними смешавшись, ходят». Много позже Григорий Котошихин написал о донцах следующее: «А люди они породою москвичи и иных городов, и новокрещеные татаровя, и запорожские казаки, и поляки, и ляхи…»

Именно тогда на Дону возникали первые временные казачьи поселения, их «зимовища и юрты», в которых они могли поселить свои семьи. Постепенно на месте некоторых из них возникли огороженные простейшими укреплениями (рвом, валом с тыном) «городки». В них казаки укрывались во время внезапного нападения татар, хранили припасы и вооружение. Первые достоверные сведения о казачьих городках относятся к 40-м гг. XVI в. В 1548 г. упоминается «острога», которую атаманы Михаил Черкашенин и Истома Извольский поставили на «Великом Перевозе» (Переволоке). Кроме этого укрепленного поселения на Дону существовало 3 или 4 «города», в которых атаманствовал Сары-Азман, возможно на «запольных» реках находились и другие казачьи поселения. Н. А. Мининков высказал предположение о существовании еще одного казачьего центра на Нижнем Дону, однако в дошедших до нас документах он не упоминается.

Московские власти не контролировали «польских» казаков, признавая тот факт, что «те разбойники живут на Дону без нашего ведома, а от нас бегают». Численность их росла. На Дон шли не только рязанские «заполяне», но и вольница из Северской земли и даже западнорусских земель. В донесении путивльского наместника Троекурова, направленном в 1546 г. в Москву, сообщалось о том, что «ныне казаков на Поле много, и черкасцов, и кыян, и твоих государевых — вышли, государь, на Поле из всех украин». К середине XVI в. казаки освоили донские и приднепровские степи и начали тревожить татар в их улусах. С нескрываемой тревогой о действиях донцов в 1551 г. писал ногайскому князю Исмаилу турецкий султан Сулейман I, по словам которого, «казаки с Озова оброк емлют и воды на Дону пить не дадут. А крымскому де царю потому ж обиды чинят великие». Перечисляя их, султан упоминает и не отраженный в русских источниках казачий набег на Перекоп.

Первый известный поход против Крыма донские казаки совершили в 1556 г. Войско во главе с атаманом Михаилом Черкашенином, возглавлявшим казаков, живших на Северском Донце, на стругах по реке Миус спустилось в Азовское море, пересекло его и разорило окрестности Керчи. Двух захваченных во время похода «языков» (татарина и турка) казаки прислали в Москву.

Приток русского населения на Дон возрос в конце XVI в. в связи с усилением податного гнета в центральных областях Русского государства, разоренного Ливонской войной и опричниной. Среди уходивших на Дон людей было немало преступников, бежавших из Московского государства от заслуженного наказания. Им на руку был старинный обычай казаков не выдавать беглых русскому правительству. «И быв на Дону хотя одну неделю или месяц, — писал Котошихин, — а лучитца им с чем-нибудь приехать к Москве, и до них впред дела никакова ни в чем не бывает никому, что кто ни своровал, потому что Доном от всяких бед свобождаютца». Эта традиция оказалась живучей и сохранилась до времен Петра I.

Правительство, стремясь унять казачьи разбои и использовать их военный опыт для борьбы с татарской угрозой, стало привлекать вольных казаков к государственной пограничной службе. Как пограничная стража служилые казаки раньше всего появились на южных «украйнах», где существовала постоянная опасность вражеского нападения. Они сыграли очень важную роль при реорганизации в 1571 г. сторожевой и станичной службы, заменив отряды детей боярских, которые были возвращены в полковую службу.

До середины XVI в вольные казаки не включались в состав русского войска, однако их действия в южнорусских степях становились все более заметными. Игнорировать это обстоятельство московские власти не могли. Наличие общего врага сближало интересы Москвы с донским и запорожским казачеством.

Эпизодические контакты правительства с донскими казаками начались в конце 40 — начале 50-х годов XVI в., а в 70-е гг. приобрели постоянный характер. В немалой степени этому способствовало то, что по Дону шли все дипломатические и торговые сношения Русского государства с Крымом и Турцией. В то время донское казачество еще не имело единой войсковой организации, поэтому для обеспечения безопасности этого пути правительству приходилось контактировать с выборными властями отдельных юртов и отрядов, размещавшихся по берегам рек бассейна Дона.