и плазмолированной клеткой лука. Этот способ можно рассматривать либо как стадию перед попаданием бактерий в цитоплазму, либо как получение ассоциаций межклеточного типа.

К сожалению, жизнеспособных систем на основе изолированных протопластов в настоящее время не получено, так как в процессе культивирования происходило разрушение либо микроорганизма, либо протопласта. Необходимы дальнейшие исследования.

Экзосимбиотические ассоциации

Партнеры те же, в основном — азотфиксаторы (Rhizobium, Azotobacter, Azospirillum), Chlorella и различные виды грибов. Общий принцип создания таких ассоциаций — совместное культивирование клеток растений с микроорганизмами. Способы ведения микроорганизмов в культуру могут быть различны: внесение микроорганизмов непосредственно в культуру; высев на поверхности агара рядом с каллусом, но без соприкосновения; разделение бактериальных клеток и культуры мембранами, обеспечивающими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими контакта между партнерами.

Рассмотрим результаты попыток создания ассоциаций с различными партнерами.

Ассоциации с клубеньковыми бактериями

Сначала создавались упрощенные модельные системы для изучения симбиоза бобовых растений с клетками растений. Каллусную ткань сои инфицировали клетками Rhizobium. Были получены подобия инфекционных нитей и бактероидов в каллусной клетке. В таких ассоциациях клетки бактерий проявляли нитрогеназную активность (НГА, отсутствующую в чистой культуре. Это свидетельствовало о процессе азотфиксации.

Далее были созданы и азотфиксирующие ассоциации Rhizobium с культурами тканей небобовых растений. В таких ассоциациях клетки бактерий были локализованы на поверхности растительных клеток, проникали вглубь каллуса по межклетникам и изредка обнаруживались внутри клеток. В основном сохраняли палочковидную форму без образования бактероидов. В большинстве таких экспериментов бактериальные клетки угнетали рост растительных и усиливали их отмирание. Сообщения о положительном взаимном влиянии единичны. Есть одна удачная попытка регенерации растений табака из ассоциации каллусной ткани с Rhizobium.

Ассоциации со свободноживущими азотфиксаторами

Azotobacter, Azospirillum живут в ризосфере растений и иногда образуют с ними ассоциации. Главная задача проведения экспериментов с этими бактериями — получение эффективных азотфиксирующих систем, растущих на среде без связанного азота, с перспективой регенерации растений.

В таких экспериментах была обнаружена видовая специфичность. Каллусные культуры табака, проса быстро "обрастали" Azospirillum, но через 4 недели погибали. Ткань сахарного тростника субкультивировали в аналогичных условиях 18 месяцев, при этом стабильные ассоциации формировались только на среде с низким содержанием связанного азота или без него. Бактерии проявляли НГА во всех случаях.

И Azotobacter, и Azospirillum в соответствующих ассоциациях были локализованы на поверхности или в межклетниках и никогда не проникали внутрь клетки. Растения-регенеранты пока не получены.

Ассоциации с зелеными водорослями

Каллус моркови инокулировали одним из штаммов Chlorella, культивировали на свету на среде с дефицитом азота, каллус жил несколько месяцев. Контрольные же растения погибали. Клетки водоросли не проникали внутрь растительных.

Ассоциации с грибами

Ткань руты раздельно культивировали с различными грибами, при этом на клетки растений влияли диффундирующие через агар выделения гриба. В некоторых случаях добавляли культуральную жидкость грибов. Совместное культивирование с Botritis allii увеличивало синтез алкалоидов в 10 раз по сравнению с контролем, а добавление культуральной жидкости — в 50 раз.

Цианобактерии в искусственных ассоциациях с растительными клетками

Цианобактерии как партнеры в искусственных ассоциациях имеют ряд особенностей:

— предполагают, что древние цианобактерии сыграли роль в формировании эукариотической клетки;

— чаще других фототрофов вступают в симбиотические отношения с другими организмами в природе;

— в симбиозах осуществляют различные метаболические функции: с автотрофами играют роль азотфиксаторов, с гетеротрофами обеспечивают партнеров продуктами фотосинтеза;

— способны выделять в среду углеводы, аминокислоты, пептиды, витамины, гормоны;

— в процессе фотосинтеза выделяют кислород, которые растения в процессе дыхания потребляют;

— находят практическое применение в улучшении обеспечения растений связанным азотом.

Препятствием могут служить различные требования к условиям культивирования: у клеток растений оптимум pH 5–5.5, а цианобактерий нейтрально-щелочной (7-10); для растительных клеток температурный оптимум 24–27 °C, для бактерий — 30–40 °C; концентрация минеральных солей в среде для выращивания растительных клеток выше, чем требуется для цианобактерий.

В исследованиях, проведенных на кафедре клеточной физиологии и иммунологии МГУ, проверялись различные сочетания партнеров, с использованием как каллусных, так и суспензионных культур. Был отмечен ряд физиологических реакций: от ингибирования одного партнера другим до взаимной стимуляции процессов жизнедеятельности.

В суспензионных культурах клеток табака и Anabaena nidulans отмечено следующее:

— взаимная стимуляция роста, когда в условиях, неоптимальных для роста каждого компонента системы, происходила взаимная стимуляция;

— двухфазность ростовых процессов: за пиком роста цианобактерий следует пик роста растительных клеток, сопровождающийся частичной деградацией цианобактерий. Предполагается, что в первой фазе роста отношения партнеров носят характер мутуализма;

— цианобактерии адсорбируются на поверхности клеток, проникают вглубь клеточных агрегатов, но часть партнеров остается в суспензии в свободном состоянии;

— растительные клетки потребляют продукты фотосинтеза цианобактерий;

— между клетками растений и микроорганизмов устанавливаются метаболические взаимодействия, которые могут привести к стимуляции видоспецифических биосинтезов растительных клеток.

Ассоциации каллусных тканей с цианобактериями получали двумя способами:

— использовали изолированные протопласты, выделенные из дефицитных по хлорофиллу участков мезофилла листа,

— использовали каллус, выделенный из бесхлорофильного участка листа, к которому подсевали суспензию A.variablis.

При этом каллусные культуры стабильно росли не менее 2 лет. Антагонизма не было.

Добавляя в среду ауксины и цитокинины, удалось вызвать органогенез у каллуса табака, ассоциированного с цианобактерией. Сформировались белые побеги регенерантов табака с участками сине-зеленого цвета, содержащими бактерии. В регенерантах из каллуса цианобактерии имели внутритканевую локализацию и обнаруживались только в листьях. Их также находили на поверхности листа, стебля (рис. 26), в сосудистой системе, устьицах.

Рис. 26. Цепочки Anabaena variabilis в углублениях складчатой поверхности стебля табака

(по Р. Г. Бутенко и др., 1987)

Результаты по получению ассоциаций цианобактерий с растениями — регенерантами представляют интерес в связи с проблемой повышения доли биологически связанного азота в азотном питании растений.

МЕТОДЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении.

Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной.

Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы,