оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.

Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37 °C путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10–12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.

Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50–60 %, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.

Другой способ оздоровления — химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20–50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40 % до 80-100 %.

СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ АССОЦИАЦИЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ С МИКРООРГАНИЗМАМИ

Цели создания ассоциаций

Создание искусственных ассоциаций — новое, сравнительно молодое направление клеточной инженерии по получению новых клеток и клеточных систем путем введения микроорганизмов в клетки или в популяции культивируемых клеток растений. Экспериментальные клеточные системы называются ассоциациями.

Ассоциации могут быть как внутриклеточные (эндосимбиотического типа), так и межклеточные (экзосимбиотического типа).

В первом случае микроорганизмы вводят в изолированные протопласты высших растений. Во втором — совместно культивируют клетки и ткани растений с микроорганизмами.

При создании ассоциаций предполагается, что клетки и их популяции должны приобретать новые свойства, обусловленные присутствием в них микроорганизмов.

Цели создания популяций:

1. Экспериментальная проверка гипотезы теории симбиотического происхождения эукариотической клетки, которое предположительно проходило через стадии эндо- и экзосимбиоза. Реконструкция отдельных стадий эволюционного процесса симбиогенеза.

2. Моделирование природных симбиотических отношений растений и микроорганизмов, играющих огромную роль в процессе фиксации атмосферного азота (обеспечение связанным азотом природных экосистем, а также агроценозов).

3. Повышение продуктивности растительных клеток-продуцентов экономически важных веществ.

4. Получение растений с новыми свойствами, при условии, что отношения, складывающиеся между клетками партнеров при совместном выращивании, сохраняются в растениях-регенерантах. В литературе обсуждаются возможность улучшения таким способом сельскохозяйственных растений, а также получение растений со способностью к автономной фиксацией азота.

Первые две цели имеют значение для решения теоретических вопросов биологии, последние две носят ярко выраженный прикладной характер.

Повышение продуктивности сельскохозяйственных растений

Одна из целей культивирования растительных клеток — получение важных для медицины и ряда отраслей промышленности веществ. Для того чтобы производство было рентабельным, необходимо культивировать их на простых по составу пита тельных средах. В то же время, среды достаточно сложны по составу и включают в себя витамины, гормоны, источники углеродного питания, так как клетки в культуре являются гетеротрофами или обладают ограниченной способностью к фотосинтезу. Совмещение в культивируемых клетках способности к фотосинтезу и биосинтезу специфических продуктов — маловероятно. Поэтому введение в такие культуры микроорганизмов, синтезирующих субстраты для роста растительных клеток или предшественники для биосинтеза полезных веществ представляется весьма заманчивым.

В микробиологии опыт смешанного культивирования есть. Он показывает, что системы микроорганизмов более эффективны, чем монокультуры. Их используют для очистки сточных вод, получения ферментов, биологически активных веществ (ауксины, витамины, антибиотики). Считается, что в биотехнологии найдут применение смешанные популяции, включающие в себя как сочетания нескольких штаммов микроорганизмов, так и представителей царств растений и животных.

Улучшение сельскохозяйственных растений предполагает получение растений, способных к фиксации молекулярного азота.

При внесении удобрений используется от 30 до 50 % внесенного азота. Другой путь поступления азота — биологическая фиксация молекулярного азота. Большая часть осуществляется азотфиксирующими симбионтами, но этот процесс характерен лишь для некоторых видов высших растений и микроорганизмов. Для повышения доли биологической фиксации азота используют 3 подхода:

1. Инокуляция азотфиксирующими микроорганизмами (бактериальные удобрения). Недостаток — низкая выживаемость интродуцируемых чистых культур и вытеснение их естественной почвенной микрофлорой.

2. Создание азотфиксирующих растений методами генной инженерии. При этом предлагается вводить гены nif в протопласты высших растений. Препятствия на этом пути: процесс требует большого количества энергии, которой нет в растительной клетке, нет также систем транспорта, запасов железа и молибдена, необходимых для синтеза нитрогеназы, нет систем защиты нитрогеназы от инактивации кислородом.

3. Введение целых азотфиксирующих организмов в растения. Такие ассоциации должны учитывать особенности организации природных азотфиксирующих симбиозов:

— целостность обоих партнеров,

— интеграция партнеров в пределах организма макросимбионта,

— относительная обособленность макросимбионта.

С помощью клеточной инженерии можно осуществить жизнедеятельность азотфиксирующих организмов в клетках и тканях культурных растений. При этом возможна проверка большого числа сочетаний партнеров. В процессе культивирования возможна также адаптация партнеров друг к другу. Кроме того, бактериальные симбионты могут быть интегрированы в ткани растений с сохранением их интактности, что позволит оградить нитрогеназу от кислорода, выделяемого растением в процессе фотосинтеза.

В настоящее время эти положения могут быть подтверждены рядом экспериментов.

Создание эндосимбиотических ассоциаций

В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы следующих систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии, цианеллы.

Существует несколько способов введения микроорганизмов в протопласты (рис. 25):

Рис. 25. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты высших растений

(по L. Folke, O.Gamborg, 1981)

1. Эндоцитоз (инвагинация плазмалеммы), при этом везикула с микроорганизмом высвобождается в цитоплазме протопласта.

2. Интеграция (слияние) мембран протопласта и микроорганизма, органеллы водорослей высвобождаются в цитоплазму протопласта, но при этом они не окружены плазмалеммой протопласта.

3. Заключение микроорганизма в искусственные мембраны — липосомы. Например, в протопласты лука вводили цианобактерии, заключенные в липидные капли.

Каждый из методов имеет свои достоинства и недостатки. В первом случае везикулы окружены цитоплазматической мембраной протопласта, в результате чего может произойти слияние с лизосомами и разрушение микроорганизма.

Во втором случае происходит нарушение целостности микроорганизма: в цитоплазме оказываются органеллы.

а) эндоцитоз (поглощение путем инвагинации мембраны)

б) слияние мембран

в) слияние мембраны протопласта с липосомой

В третьем случае в цитоплазме оказываются интактные микроорганизмы, что является одним из условий воспроизведения естественного симбиоза. Такого же результата можно достичь используя метод микроинъекций (например — цианобактерий) в пространство между стенкой