1. Алберте Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1. М.: Мир, 1994.

2. Артамонов В. И. Биотехнология — агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1989. 160 с.

3. Артамонов В.И. Сельские профессии биотехнологии. М.: Изд-во МСХА, 1992. 127 с.

4. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

5. Березин И.В., Клесов А. А., Швядас В.К., Угарова Н.Н., Варфоломеев С.Д., Ярополов А.И., Казанская Н.Ф., Егоров А.М. Инженерная энзимология. // Биотехнология. Кн. 8. М.: Высшая школа, 1987. 143 с.

6. Герасименко В.Г. Биотехнология. Киев: Выща школа, 1989. 343 с.

7. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М., Пичугина Е. М., Фрейдин М.И., Чериков В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 251–260.

8. 3авертляев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л.: Агропромиздат, 1989. 255 с.

9. Какпаков В. Т. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 241–250.

10. Конюхов Б. В. Долли — случайность или закономерность? // Человек. 1998. № 3

11. Крыжанов М.А., Залесских А.Ф., Троицкая М.В., Соловьев В.В., Тихомиров А.И. Культивирование клеточной линии НЕР-2 на микроносителях с целью получения вируса полиомиелита. // Биотехнология и генетика. Н.Новгород, 1991. С. 87–92.

12. Прудовский И.А., Сухарев С.И. Гибридизация клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 176–193

13. Рингертц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М.: Мир, 1979. 412 с.

14. Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж. Б. и др. Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989. Т. 1, 2.

15. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 44–63.

16. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 318 с.

17. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194–205.

18. Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63–69.

19. Wilmut I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cell line // Nature. 1997. V.385. P. 810–813.

Генная инженерия

ВВЕДЕНИЕ В ГЕНЕТИЧЕСКУЮ ИНЖЕНЕРИЮ

Возможности генной инженерии

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (Е. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200–250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков Е. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках Е. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Соматотропин — гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4–6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре Е. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как Е. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов, как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.

Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Генная инженерия как наука, методы

Генетическая инженерия — конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе — создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия — система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных