К началу войны (1 августа 1914) было построено уже 4 «Ильи Муромца». К сентябрю 1914 года они были переданы в Императорский военно-воздушный флот. 1-й «Муромец» под командованием штабс-капитана Руднева вылетел на фронт 31 августа (13 сентября) 1914 года, но из-за аварии достиг Белостока только 23 сентября и принял участие в разведке осажденного австрийского Перемышля лишь в ноябре. Устаревшая артиллерия Перемышля не была приспособлена для зенитной стрельбы, и летчики на «Фарманах» отваживались летать над крепостью на высоте 500–600 м, благополучно возвращаясь на базу. Руднев же не рисковал приближаться к крепости и производил наблюдения издали с высоты 1000 м. Второй корабль поручика Панкратьева 24 сентября при вылете на фронт потерпел аварию в Режице, причем потребовалась замена шасси и моторов.

10 (23) декабря 1914 года было утверждено императором постановление военного совета о создании эскадры бомбардировщиков «Илья Муромец» (Эскадра воздушных кораблей, ЭВК), ставшей первым в мире соединением бомбардировщиков. Однако она долгое время оставалась на бумаге, поскольку не хватало летчиков, умевших летать на «Муромцах».

14 февраля 1915 года «Илья Муромец Киевский» под командой штабс-капитана Горшкова вылетел на разведку переправ на реке Висла у Плоцка, но из-за сильной облачности вернулся, не обнаружив целей. На следующий день корабль впервые произвел бомбометание, и две пудовые бомбы были сброшены на батареи, а три – на обоз. 21 февраля 1915 года он вылетел с 5 двухпудовыми фугасными бомбами и одной пристрелочной на станцию Вилленберг, но бомбы не сбрасывал. Утром следующего дня Горшков, смущенный неполным выполнением задания, в тайне от всех вылетел по уже знакомому маршруту, в первом заходе произвел пристрелку, а во втором сбросил пять бомб. Затем он сфотографировал станцию и благополучно вернулся. 24 и 25 февраля на ту же станцию было сброшено свыше 30 пудов (480 кг) бомб. За три полета, по донесению из штаба армии, «разрушено станционное здание и пакгауз, шесть товарных вагонов и вагон коменданта, причем комендант убит, в городе разрушено несколько домов, убито два офицера и 17 нижних чинов, семь лошадей. В городе паника. Жители в ясную погоду прячутся в погребах».

Во время войны начато производство самолётов серии В, наиболее массовой и насчитывавшей 30 машин. Они отличались от серии Б меньшими размерами и большей скоростью. В 1915 году начался выпуск серии Г с экипажем 7 человек.

Вооружение «Муромцев» состояло из винтовок, карабинов и ручных пулеметов «Мадсен», последние часто отказывали, также использовались «максимы». В начале 1915 года эскадра получила пулеметы «Льюис» с обоймами на 40 патронов, по 3–4 пулемета на корабль. В следующем году были получены пулеметы «Виккерс» и «Кольт». «Муромцы» использовали фугасные, осколочные и зажигательные бомбы калибром от 2,5 до 410 кг, а также стальные метательные стрелы. Последние были не слишком эффективны, поскольку вероятность попасть такой стрелой в человека или лошадь была крайне мала.

В то же время эффективность «Муромцев» относительно их стоимости была сравнительно невелика. Цена «Муромцев» составляла 150 000 рублей за одну машину при цене одномоторного аэроплана Сикорского в 7-14 000 рублей. При этом бомбовая нагрузка «Муромца» лишь ненамного превосходила бомбовую нагрузку одномоторных самолетов. Преимущество же их в дальности полета большой роли не играло, так как русская авиация использовалась только для поддержки сухопутных войск.

Первые «Муромцы» брали в боевой вылет до 10–20 пудов бомб (160–320 кг), 22 июля 1915 г. с «Муромца» штабс-капитана Панкратьева была сброшена опытная 25-пудовая (400 кг) бомба без взрывчатки. В феврале 1916 года «Муромцы» сбрасывали уже по 25–30 пудов (400–480 кг) бомб.

За годы войны в войска поступило 60 машин. Эскадра совершила 400 боевых вылетов, сбросила 65 тонн бомб и уничтожила 12 вражеских истребителей. Только за 1915 год корабли выполнили до ста вылетов, сбросив около 20 т бомб.

Первый «Муромец» был потерян в бою 5 июля 1915 года, когда машину поручика Башко последовательно атаковали три истребителя «Альбатрос». Самолет совершил вынужденную посадку, с него сняли моторы и отправили на склад. 2 ноября 1915 года «Муромец» штабс-капитана Озерского возвращался после бомбардировки станции Барановичи, во время которой подвергся сильному зенитному обстрелу. У самолета были перебиты тросы, ведущие к элеронам, и он врезался в землю у Прилук. Почти весь экипаж погиб.

19 марта 1916 года «Муромец» с 450 кг бомб был атакован двумя «фоккерами», получил более 40 попаданий, но смог отбиться. 2 члена экипажа были ранены, а 1 умер в госпитале от потери крови.

13 апреля 1916 года при бомбардировке станции Даудзевас был серьезно поврежден и списан «Муромец» поручика Констенчика, а сам пилот ранен. В апреле 1916 года 7 немецких аэропланов также разбомбили аэродром в Зегевольде, в результате чего получили повреждения 4 «Муромца».

12 (25) сентября 1916 года во время налёта на штаб в д. Антоново и станцию Боруны истребителями был сбит самолет поручика Д. Д. Макшеева. В этот день был запланирован вылет 3-го отряда «Муромцев» (4 самолета), 12 «Вуазенов» и двух отрядов истребителей «Моран-Парасоль». Но взаимодействия организовано не было. Один «Муромец» стартовать не смог из-за возгорания моторов, а другой вернулся, не перелетев позиций противника, в связи с «отсутствием опытного помощника у командира». Поэтому немцы смогли сбить «Муромец» поручика Макшеева, повернувшего обратно из-за неполадки с мотором, и «Вуазен». Лейтенант Вольф из немецкого полевого авиаотряда утверждал, что именно он сбил «Муромец». Сначала огонь был открыт с дистанции 150 м, был поврежден один из правых моторов. Ответный огонь «Муромца» также попал в цель, но истребитель, маневрируя, подошел до 50 м, наблюдатель лейтенант Лозе вел огонь по кабине. Вскоре «Муромец» начало заваливать, и он перешел в крутую спираль, затем в штопор. Вместе с ним погиб один «Моран».

Но самой распространённой причиной потерь были технические неполадки и различные несчастные случаи – из-за этого было потеряно около 20 машин. После Октябрьской революции боевое использование «Муромцев» прекратилось вплоть до окончания войны.

Высокая аварийность «Муромцев» была связана, в частности, с тем, что немецкие двигатели «Аргус», под которые проектировался «Муромец», с началом войны были недоступны, а французский «Сальмсон» и британский «Санбим» отличались большим лобовым сопротивлением и ненадежностью, запасные части отсутствовали, механики и мотористы были недостаточно подготовлены. Сами самолеты изнашивались, и росли потери по эксплуатационным причинам. Поэтому в январе – феврале 1916 года из всей эскадры из 10 самолетов боеспособным был лишь один, в октябре было совершено всего два вылета одним самолетом, а в ноябре и декабре последовал лишь один вылет, состоявшийся 22 ноября. В начале 1917 года из 30 «Муромцев» на фронте находилось лишь 4, из которых два за зиму вообще не совершали боевых полетов из-за устаревших или плохо работавших моторов. Не хватало и обученных экипажей.

Всего из 51 самолета, поступившего на фронт, воевало только 40 машин. Если в 1916 году самолеты совершили максимальное число вылетов – 156 и сбросили до 19 т бомб, то за 1917 год было лишь около 70 боевых вылетов, во время которых было сброшено 10,7 т бомб.