К 2010 году проект по изучению CRISPR расширился, в него вошли еще несколько участников моей команды, включая соавтора этой книги Сэма Стернберга, и атмосфера в лаборатории буквально искрилась от радостного возбуждения. Наше понимание CRISPR, казалось, улучшалось каждую пару недель, а у изучаемых нами ферментов открывались интересные и необычные свойства, которые, как мы понимали, могут иметь практическое применение. К примеру, мы заинтересовались идеей использования новых ферментов, разрезающих РНК, в качестве своего рода диагностического инструмента для выявления отличительных молекул РНК вирусов человека, включая вирусы лихорадки Денге и желтой лихорадки; для воплощения этой идеи мы получили грант от фонда Билла и Мелинды Гейтс. Вскоре мы стали сотрудничать с биоинженерной лабораторией в Беркли, чтобы совместить эту технологию с их инновационной системой обработки крошечных количеств жидкости для выявления вирусов в крови или слюне.

Затем в 2011 году мы с Рэйчел основали компанию под названием Caribou Biosciences, чтобы начать получать доход от Cas-белков. В то время мы мечтали создать простые наборы инструментов, которыми могли бы пользоваться ученые и даже врачи для выявления вирусной или бактериальной РНК в биологических жидкостях. Для нас обеих этот выход за пределы фундаментальных научных исследований открыл двери в удивительный новый мир. Следующей весной, защитив свою кандидатскую диссертацию, Рэйчел стала президентом и генеральным директором молодой и быстро растущей компании; я стала научным советником – эта должность позволяла мне делать вклад в проекты Caribou и вместе с тем успевать выполнять все университетские дела. Позже Caribou прославилась благодаря другой технологии, связанной с CRISPR, – куда более продвинутой.

В то время наши с Блейком основные интересы сместились с ферментов, режущих молекулы ДНК или РНК бактериальной системы CRISPR, на белки, разрезающие вирусную ДНК, – то есть в операции “найти и унитожить”, которую проводит CRISPR, они отвечают за “уничтожить”. Мы полагали, что, как только РНК CRISPR идентифицирует вирусную ДНК и соединяется с ней, специальные ферменты атакуют этот чужеродный генетический материал, разрезают его на части и обезвреживают. Интересные свидетельства в пользу этой гипотезы приходили от наших коллег по изучению CRISPR, среди которых были Сильвен Мойно из Университета Лаваля в Канаде и Виргиниюс Шикшнис из Вильнюсского университета. Исследование Сильвена показало, что ДНК фага, на которую нацеливается система CRISPR, разрезается[69] в пределах последовательности, совпадающей с РНК CRISPR, а Виргиниюс обнаружил, что уничтожение фагов в бактерии зависит от присутствия определенных cas-генов[70]. Понимание того, каким образом генетический материал фага в конечном счете разрушается в ходе иммунного ответа, подвело бы нас к пониманию сути всей системы CRISPR в целом.

Исследование Блейка в сочетании с работой наших коллабораторов в лаборатории Джона ван дер Ооста лишь приоткрыло всю сложность этого процесса уничтожения вируса. В двух бактериальных системах, которые мы исследовали, – E. coli и P. aeruginosa – клеткам нужны были многочисленные Cas-белки для нацеливания на вирусную ДНК и ее расщепления. К тому же скоординированная атака на генетический материал фага проходила в два отдельных этапа. Сначала молекула РНК CRISPR связывалась с куда более крупной структурой, содержащей, как показало исследование ван дер Ооста, около десяти или одиннадцати разных Cas-белков. Этой молекулярной машине исследователи дали яркое название Cascade (аббревиатура выражения “связанный с CRISPR комплекс для противовирусной защиты”, CRISPR-associated complex for antiviral defense), и она служит чем-то вроде GPS-координат, определяющих точную последовательность вирусной ДНК, подлежащей уничтожению. На втором этапе, после того как Cascade определяла и помечала совпадающую последовательность ДНК, подлежащую уничтожению, появлялся белковый фермент под названием Cas3 – еще одна нуклеаза и, собственно, само оружие атаки, – чтобы разрезать целевую ДНК.

Проводя опыты для серии статей, которые мы опубликовали в 2011–2012 годах, мы еще лучше поняли механику этого процесса. Используя мощь электронного микроскопа и тесно сотрудничая с профессором Беркли Эвой Ногалес и ее постдоком Гейбом Ландером, мы получили первые изображения структуры Cascade[71] в высоком разрешении. Эти изображения показали, что структура Cas-белков и молекул РНК CRISPR спиралеобразная; можно было наблюдать, как микроскопическая машина плотно оборачивалась вокруг вирусной ДНК, подобно питону, обвивающему газель. Мы были поражены, увидев, как красиво менялась ее трехмерная форма для выполнения геометрической задачи, необходимой для нацеливания на ДНК. Мы также осознали важность взаимодействий, способствующих образованию пар оснований и позволяющих “буквам” РНК CRISPR распознавать комплементарные “буквы” вирусной ДНК; мы обнаружили, что Cascade действует удивительно точно, прикрепляясь только к тем мишеням на вирусной ДНК, которые полностью или практически полностью совпадают с РНК CRISPR. Столь высокая разборчивость позволяла Cascade избегать случайного нацеливания на собственную ДНК бактерии и ее уничтожения – катастрофического аутоиммунного события, которое бы вызвало быструю смерть клетки.

Дополнительные исследования в литовской лаборатории Виргиниюса Шикшниса показали, каким образом фермент Cas3 уничтожает вирусную ДНК, которую Cascade выбрала в качестве мишени[72]. В отличие от более простых нуклеаз, Cas3 не надрезал ДНК один раз, а “разжевывал” ее на сотни кусочков. Как только Cascade отправляла Cas3 к месту, где последовательности РНК CRISPR и вирусной ДНК совпадают, Cas3 начинал двигаться вперед и назад вдоль генома фага со скоростью свыше трех сотен пар нуклеотидов в секунду, нарезая ДНК и превращая длинный геном фага в беспорядочную кучу обломков. Если более простые нуклеазы можно уподобить секатору, то Cas3 уместно сравнить с механизированными садовыми ножницами. Его скорость и эффективность поражают.

По мере того как наши коллеги делали эти удивительные открытия, а моя лаборатория продолжала получать новые биохимические и структурные данные, загадочный поначалу механизм работы CRISPR обретал ясность: становилось видно, какие молекулы входят в его состав и что они делают. Однако в то же время мы начинали осознавать, что иммунная система CRISPR представляет собой нечто вроде движущейся цели: существует не одна система, а множество ее вариаций. Некоторые ученые, включая Евгения Кунина и Киру Макарову, это уже предсказывали, сравнивая различные наборы cas-генов, примыкающих к последовательностям CRISPR; мы же открыли это явление благодаря резко возросшему количеству геномов бактерий и архей, которые к тому времени секвенировали исследователи, имевшие доступ к более совершенным инструментам. Иммунные системы CRISPR оказались очень разнообразными, и их можно было сгруппировать во множество различных категорий – у каждой свой уникальный набор cas-генов и Cas-белков.